Pracovný princíp Pasteurovej pipety je primárne založený na gravitačnom-prúde a kapilárnom pôsobení v kombinácii s ručným ovládaním rozdielov tlaku vzduchu na uľahčenie nasávania a prenosu kvapalín.
Manuálne ovládanie nasávania: Operátor nasáva široký koniec pipety-buď orálne, alebo pomocou pomocnej gumenej guľôčky-, aby vytvoril podtlak v trubici, čím nasaje kvapalinu do jemnej špičky.
Dávkovanie poháňané gravitáciou-: Po uvoľnení sania kvapalina vyteká prirodzene pod vplyvom gravitácie; dávkovaniu môže pomôcť aj jemné stlačenie tela pipety alebo naklonenie prijímacej nádoby.
Reprodukovateľnosť kvapiek: Kalibráciou pomeru „kvapiek na mililiter“ umožňuje pipeta približný kvantitatívny prenos, vďaka čomu je vhodná pre postupy, ktoré vyžadujú skôr opakovateľnosť než absolútnu presnosť.
Zaistenie sterility: Pred použitím je možné do širokého konca vložiť vatový tampón a sterilizovať, aby sa zabránilo mikrobiálnej kontaminácii počas manipulácie-, čo je postup, ktorý je obzvlášť bežný pri mikrobiologických experimentoch.